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高效液相色譜儀以下幾個(gè)錯(cuò)誤的操作方式要避免
  • 發(fā)布日期:2025-08-28      瀏覽次數(shù):330
    • 高效液相色譜儀以下幾個(gè)錯(cuò)誤的操作方式要避免

      高效液相色譜儀(HPLC)作為精準(zhǔn)分析檢測(cè)的核心設(shè)備,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域,其操作規(guī)范性直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性,以及儀器的使用壽命。在實(shí)際操作中,若忽視細(xì)節(jié)或違反操作規(guī)程,易引發(fā)柱效下降、檢測(cè)器故障、數(shù)據(jù)失真等問題。以下從四個(gè)核心環(huán)節(jié),梳理高效液相色譜儀必須避免的錯(cuò)誤操作方式,為實(shí)驗(yàn)操作提供科學(xué)指引。
      一、流動(dòng)相處理:忽視純化與脫氣,埋下系統(tǒng)隱患
      流動(dòng)相作為 HPLC 分析的 “載體",其純度、脫氣效果直接影響色譜柱性能與檢測(cè)精度,常見錯(cuò)誤操作集中在以下兩點(diǎn):
      • 錯(cuò)誤 1:直接使用未經(jīng)過濾的流動(dòng)相。部分操作人員為節(jié)省時(shí)間,將未經(jīng)過 0.22μm(或 0.45μm)濾膜過濾的甲醇、乙腈或緩沖液直接倒入溶劑瓶。流動(dòng)相中可能含有的微小顆粒(如試劑雜質(zhì)、塵埃)會(huì)隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱,堵塞柱內(nèi)填料孔隙,導(dǎo)致柱壓驟升、柱效快速下降,甚至造成色譜柱損壞;同時(shí),顆粒還可能污染進(jìn)樣閥與檢測(cè)器流通池,影響儀器正常運(yùn)行。正確做法是:所有流動(dòng)相(包括水相、有機(jī)相、緩沖液)均需通過對(duì)應(yīng)孔徑的濾膜過濾,且水相、有機(jī)相需使用不同濾膜(水相用親水膜,有機(jī)相用疏水膜),避免濾膜溶解污染流動(dòng)相。

      • 錯(cuò)誤 2:流動(dòng)相未脫氣。若直接使用未脫氣的流動(dòng)相,其中溶解的氧氣、氮?dú)獾葰怏w在色譜柱中因壓力變化會(huì)釋放氣泡,氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)導(dǎo)致基線劇烈波動(dòng)、出現(xiàn)尖銳雜峰,嚴(yán)重時(shí)會(huì)中斷流動(dòng)相輸送,造成分析數(shù)據(jù)失真;此外,溶解氧還可能與流動(dòng)相中的有機(jī)相(如甲醇)或樣品發(fā)生反應(yīng),影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。正確做法是:采用超聲脫氣(一般超聲 15-20 分鐘)、在線脫氣或真空脫氣等方式,尤其在使用緩沖液或混合流動(dòng)相時(shí),需延長(zhǎng)脫氣時(shí)間,避免氣泡殘留。

      二、樣品準(zhǔn)備:預(yù)處理不當(dāng),導(dǎo)致分析結(jié)果失真
      樣品預(yù)處理是 HPLC 分析的關(guān)鍵前序步驟,錯(cuò)誤操作會(huì)直接影響分離效果與定量準(zhǔn)確性:
      • 錯(cuò)誤 1:樣品未過濾或過濾不規(guī)范。若將含有懸浮顆粒、絮狀物的樣品直接進(jìn)樣,顆粒會(huì)堵塞進(jìn)樣針、進(jìn)樣閥,甚至隨樣品進(jìn)入色譜柱,與流動(dòng)相中的雜質(zhì)共同加劇柱污染;同時(shí),顆粒在檢測(cè)器中會(huì)產(chǎn)生假信號(hào),導(dǎo)致色譜峰形拖尾、基線漂移,無法準(zhǔn)確判斷樣品組分。正確做法是:使用 0.22μm(與流動(dòng)相濾膜孔徑一致)的針式濾頭對(duì)樣品進(jìn)行過濾,過濾時(shí)需棄去初始幾滴濾液,避免濾頭污染樣品;對(duì)于粘稠度較高的樣品,需先進(jìn)行稀釋或離心處理,再進(jìn)行過濾。

      • 錯(cuò)誤 2:樣品溶劑與流動(dòng)相不兼容。部分操作人員為方便,使用與流動(dòng)相極性差異過大的溶劑溶解樣品(如用純甲醇溶解需用磷酸鹽緩沖液 - 乙腈作為流動(dòng)相的樣品),會(huì)導(dǎo)致樣品進(jìn)入色譜柱后因溶劑與流動(dòng)相混合不均,出現(xiàn) “溶劑效應(yīng)"—— 表現(xiàn)為色譜峰分裂、峰形不對(duì)稱、保留時(shí)間漂移,嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響組分分離度,無法準(zhǔn)確定量。正確做法是:選擇與流動(dòng)相初始比例(或極性相近)的溶劑溶解樣品,若樣品在流動(dòng)相中溶解度較低,可適當(dāng)提高有機(jī)相比例,但需確保溶劑與流動(dòng)相混合后無分層、無沉淀。

      三、儀器操作:參數(shù)設(shè)置與操作流程錯(cuò)誤,損傷儀器部件
      儀器操作環(huán)節(jié)的不規(guī)范,不僅影響分析效率,還可能對(duì)色譜柱、檢測(cè)器等核心部件造成不可逆損傷:
      • 錯(cuò)誤 1:開機(jī)后直接升壓,未進(jìn)行系統(tǒng)排氣。開機(jī)后若未先開啟泵進(jìn)行低流速(如 0.2-0.5mL/min)排氣,直接將流速升至分析流速并升壓,會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)殘留的氣泡被壓縮在管路或色譜柱中,形成 “氣塞",造成柱壓異常升高;同時(shí),突然升壓會(huì)對(duì)色譜柱填料產(chǎn)生沖擊,導(dǎo)致填料顆粒塌陷,縮短色譜柱使用壽命。正確做法是:開機(jī)后先將泵流速調(diào)至 0.5mL/min,打開排液閥(或斷開色譜柱入口端),待流出液無氣泡后,關(guān)閉排液閥(或連接色譜柱),再逐步升高流速至分析條件,避免流速驟升驟降。

      • 錯(cuò)誤 2:分析結(jié)束后未及時(shí)沖洗系統(tǒng)與色譜柱。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后若直接關(guān)機(jī),流動(dòng)相中殘留的緩沖液(如磷酸鹽、醋酸鹽)會(huì)在色譜柱內(nèi)干燥結(jié)晶,堵塞填料孔隙;同時(shí),緩沖液與有機(jī)相混合后若長(zhǎng)時(shí)間停留,可能產(chǎn)生沉淀,污染進(jìn)樣閥與檢測(cè)器流通池;對(duì)于反相色譜柱,若未用純有機(jī)相(如甲醇、乙腈)封存,柱內(nèi)殘留的水相會(huì)導(dǎo)致填料水解,降低柱效。正確做法是:分析結(jié)束后,先使用不含緩沖鹽的流動(dòng)相(如甲醇 - 水)沖洗系統(tǒng) 20-30 分鐘,再用純有機(jī)相沖洗色譜柱 30 分鐘以上(確保柱內(nèi)無緩沖鹽殘留),最后關(guān)閉泵與檢測(cè)器,待柱溫降至室溫后關(guān)機(jī)。

      • 錯(cuò)誤 3:檢測(cè)器操作不當(dāng),影響檢測(cè)精度。常見錯(cuò)誤包括:紫外檢測(cè)器未進(jìn)行基線校正即開始分析,導(dǎo)致基線漂移影響峰面積積分;熒光檢測(cè)器未開啟氙燈預(yù)熱,直接進(jìn)行檢測(cè),導(dǎo)致光源強(qiáng)度不穩(wěn)定,出現(xiàn)熒光信號(hào)波動(dòng);檢測(cè)器流通池污染后未及時(shí)清洗,殘留的樣品或流動(dòng)相在流通池內(nèi)吸附,導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降,出現(xiàn)假陰性結(jié)果。正確做法是:開機(jī)后需對(duì)檢測(cè)器進(jìn)行基線校正(紫外檢測(cè)器需預(yù)熱 30 分鐘以上),熒光檢測(cè)器需提前開啟氙燈預(yù)熱 1 小時(shí);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,需用合適的溶劑(如甲醇、乙腈)沖洗流通池,若流通池污染嚴(yán)重,可使用稀硝酸(針對(duì)金屬離子污染)或超聲清洗(需拆卸流通池,按儀器說明書操作)。

      四、維護(hù)保養(yǎng):長(zhǎng)期忽視維護(hù),縮短儀器使用壽命
      高效液相色譜儀的定期維護(hù)是保障其穩(wěn)定運(yùn)行的基礎(chǔ),忽視維護(hù)易導(dǎo)致儀器故障頻發(fā):
      • 錯(cuò)誤 1:長(zhǎng)期不更換進(jìn)樣針與密封圈。進(jìn)樣針長(zhǎng)期使用后,針尖易磨損或變形,導(dǎo)致進(jìn)樣體積不準(zhǔn)確,出現(xiàn)定量重復(fù)性差;進(jìn)樣閥密封圈長(zhǎng)期受流動(dòng)相腐蝕、樣品摩擦,會(huì)出現(xiàn)密封不嚴(yán),導(dǎo)致流動(dòng)相泄漏、進(jìn)樣交叉污染(前一樣品殘留影響后一樣品分析)。正確做法是:每使用 500-1000 次進(jìn)樣針后,檢查針尖狀態(tài),若出現(xiàn)磨損及時(shí)更換;進(jìn)樣閥密封圈每使用 3-6 個(gè)月(或出現(xiàn)泄漏時(shí))更換,更換時(shí)需注意密封圈型號(hào)與安裝方向,避免安裝錯(cuò)誤導(dǎo)致密封失效。

      • 錯(cuò)誤 2:色譜柱儲(chǔ)存與使用不當(dāng)。將不同類型的色譜柱(如反相柱、正相柱)混合儲(chǔ)存,未標(biāo)注使用記錄,易導(dǎo)致色譜柱誤用(如用反相柱分析正相樣品);色譜柱長(zhǎng)期不用時(shí),未按要求用專用溶劑封存(如正相柱用正己烷 - 異丙醇封存),導(dǎo)致柱內(nèi)填料干裂或受潮;使用時(shí)隨意改變色譜柱溫度范圍(如超過色譜柱標(biāo)注的最高溫度),導(dǎo)致填料性能退化,柱效下降。正確做法是:色譜柱儲(chǔ)存時(shí)需標(biāo)注型號(hào)、使用時(shí)間、上次分析樣品類型,按極性或類型分類存放;長(zhǎng)期不用時(shí),用對(duì)應(yīng)的封存溶劑沖洗后密封兩端,存放于陰涼干燥處;使用時(shí)嚴(yán)格遵守色譜柱的溫度、pH 范圍要求,避免超范圍使用。

      總之,高效液相色譜儀的操作需嚴(yán)格遵循 “預(yù)處理規(guī)范、參數(shù)設(shè)置精準(zhǔn)、維護(hù)及時(shí)" 的原則,避免上述錯(cuò)誤操作。只有規(guī)范操作流程,才能保障分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性,延長(zhǎng)儀器使用壽命,為實(shí)驗(yàn)研究與質(zhì)量檢測(cè)提供有力支撐。

      高效液相色譜儀都在哪些領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用呢?

      高效液相色譜儀以下幾個(gè)錯(cuò)誤的操作方式要避免

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